对虾桃拉综合症病毒（Taura syndrome virus，TSV）和白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害对虾养殖的两种重要病原，目前尚无特异性治疗对虾病毒的药物。

 

　　本研究参考已报道的TSV和WSSV的全基因组序列，在全面分析基因组信息的基础上寻找WSSV（VP19和VP28）和TSV（CP1和CP2）保守区域，分别设计抗对虾病毒的特异性反义核酸，采用特定工艺人工合成对应的肽核酸片段。以南美白对虾为研究对象，分别感染WSSV和TSV，采用投喂给药法，先筛选出抗病毒效果较好的反义核酸作为优选药物。在此基础上，将优选的反义核酸药物再组合分别形成抗WSSV和TSV的特异性抗病毒药物，以此展开临床实验，分析它们在对虾上抗WSSV和TSV的效果。实验结果表明，实验设计的VP19-1，VP19-2，VP28-2，CP1-1，CP1-3，CP2-2和CP2-3抗病毒效果较好，作为优选序列。临床实验表明，针对WSSV和TSV的反义核酸的保护率分别达到98%和97%。同时毒性试验结果显示，所合成的反义肽核酸毒性极低。综合上述结果，采用肽核酸技术合成的针对对虾WSSV和TSV的反义核酸可以成功应用于抗病毒用途，且经工艺改造后可采用投喂方法给药，具有给药方便的特点，稳定性也较高，这些特性提示可作为对虾的抗病毒药物在临床使用。

 

　　对虾桃拉综合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）和白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）是当前严重危害对虾养殖业健康发展的两种主要对虾病毒性传染病。根据世界银行的虾病报告，1994年全球养殖对虾病毒病造成74%的产量损失，其经济损失达30亿美元以上。对虾白斑综合征于1992年首次发现于台湾，1993年5-8月在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，现已扩展到世界沿海各国。WSSV主要引起对虾甲壳内侧白斑病变，该病可感染各生长阶段的对虾，发病率和死亡率都很高，发病对虾3-10天死亡率可达到100%。WSSV是线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）中一种新型的DNA病毒，其DNA为双链，具有双层囊膜，不形成包涵体，形态为短杆状。迄今为止，WSSV已确认的与致病有关的基因主要有：编码囊膜蛋白基因、编码核衣壳蛋白基因、编码病毒复制过程关键酶基因、与病毒潜伏相关的基因和阻止宿主细胞凋亡的基因等。Genbank上公布的3个WSSV全基因组序列各自具有不同的开放阅读框编码系统，泰国株全序列共184个开放阅读框，中国大陆株和中国台湾株各自有531个开放阅读框。

 

　　对虾桃拉综合征病毒（TSV）是危害对虾养殖的另一个重要病原，主要症状是：感染TSV的对虾体色变深，体表发红，呈深红色或褐色，尤其是尾扇和游泳足更为明显，甲壳易软，空胃，严重者病虾肝胰脏肿大或糜烂，体表可出现大量大小不一、散状分布的不规则黑色斑点等，离水易死亡，死亡率可达60%-90%。该病于1992年首次在南美洲的厄瓜多尔地区暴发，随后向世界各地的对虾养殖区域传播。TSV为单股正链RNA病毒，全长约10kb，属双顺反子病毒科（Dicist roviridae），但尚未确定属。它具有两个开放读码框架（ORF），ORF1编码为非结构蛋白，有解旋酶、蛋白酶、RNA依赖的RNA聚合酶；ORF2则编码3种结构蛋白，分别为CP1（40kDa）、CP2（55kDa）及CP3（24kDa）。

 

  　　对虾病毒的大规模爆发目前尚未有切实有效的防治手段。随着生物技术的发展，一些新兴的生物技术给对虾病毒病的防治提供了新的选择。在这些技术中，反义核酸技术因其高效性和特异性而倍受关注。反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因（mRNA或DNA）的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNaseH识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸作为生物的一种先天性病毒防御机制，自被发现以来，它很快被发展成为一种病毒病的治疗手段。对虾作为较低等的无脊椎动物，其吸收内化双链DNA/RNA的能力要高于哺乳动物，这就使得双链DNA/RNA的导入相对比较容易。鉴于这些特点，在对虾上利用反义核酸技术对病毒性疾病进行控制比哺乳动物更容易实现。人工合成的反义核酸在实验室水平可获得良好的效果，但到临床应用却受到限制，主要由于它们的不稳定性，易被降解。开发稳定性好，特异性强的药物成为当前研究的新方向。肽核酸，是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，可以序列特异地靶向作用于DNA的大沟槽，其骨架的结构单元为N（2-氨基乙基）-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上，被认为是反义核酸的第三代成熟产品。　　

　　膜蛋白在病毒的入侵、包装和释放中起着重要的作用。本试验针对WSSV（VP19和VP28）与TSV（CP1和CP2）4个基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列，采用特定工艺合成、肽修饰及壳聚糖包装反义寡核苷酸药物基因片段，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。以南美白对虾为实验动物，进行检测这几种药物的抗病毒效果，并分析了其毒副作用及稳定性等。　　

　　一、材料与方法

　　1、材料　　

　　南美白对虾，每尾10克左右，体长10-12cm，具体分组见下述各实验。试验期间水温为（22±2)℃，海水比重为1.018。　　

　　2、病毒悬液的制备　　

　　白斑综合征病毒由楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供，保存于本实验室-80℃冰箱。病毒悬液的制备过程：10g对虾病料在500mLTris·Cl-NaCl（TN缓冲液)中匀浆，4℃3500×g离心5min，上清液经400目尼龙网过滤后于4℃30000×g离心30min，弃上清，沉淀悬于10mLTN缓冲液，经3500×g离心5min后，于4℃、30000×g离心20min，沉淀中的病毒粒子重悬浮于1mLTN缓冲液。并用PCR进行定量分析，将所制备的病毒悬液用生理盐水调到合适浓度。　　

　　TSV病毒悬液制备方法基本同于WSSV方法。　　

　　3、WSSV和TSV反义核酸的设计、合成及修饰　　

　　WSSV（VP19和VP28）与TSV（CP1和CP2）4个基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列（见表1和2），采用特定工艺以肽核酸形式合成及壳聚糖包装反义寡核苷酸药物基因片段，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。　　

　　4、人工感染试验　　

　　（1）WSSV感染　　

　　参考纪荣兴等方法，略作改进。从南美白对虾倒数第二腹节处进行注射。感染不给药组对虾每尾注射白斑病毒悬液100μL；空白对照组注射等量0.9%无菌生理盐水；感染给药物组对虾每尾注射WSSV病毒悬液，拌料给药物0.2mg/天/只。注射后每日观察、记录活动情况，发病症状，死亡情况等，如甲壳内侧有明显白斑、活力迅速下降等。并连续观察10d，每天换水30%，早晨与傍晚各投饵一次。　　

　　（2）TSV感染：TSV感染方法同于WSSV感染方式，略作调整。　　

　　5、病毒检测方法　　

　　（1）WSSV检测　　

　　WSSV检测方法参照潘忠诚等，具体方法如下：　　

　　模板的制备：取患WSSV南美白对虾肌肉组织加PBS冰浴匀浆，将匀浆液6000rpm离心5min。取上清加入蛋白酶K55℃作用15min，然后立即放于冰上5min后，以8000rpm离心10min。吸上清用作PCR模板。　　

　　PCR反应体系：PCR buffer，水、Taq酶、dNTPs、引物1、引物2、模板。PCR操作程序按文献进行。　　

　　套式PCR：取PCR—扩产物为模板，以另外一对内引物为引物，按前述PCR操作程序进行二扩。

　　引物：　　

　　一扩引物：　　

　　F1：5’-CGTGCCTGAATCAGT　　

　　ATGTACGC-3’；　　

　　R1：5’-GACGTTACAATAGAC　　

　　CCATGTTCGAT-3’；

　　二扩引物：　　

　　F2：5’-CTCATGTACCAAATC　　

　　TGGGTTACGA-3’；　　

　　R2：5’-CGATAGACCACAAGT　　

　　TCCGTAGGA-3’。

　　（2）TSV检测　　

　　TSV检测参考文献进行，简要步骤如下：RT-PCR技术是目前检测TSV的最通用方法，该方法检测费用较低，并且具有快速、敏感的特点。扩增体系（20μL）：Real-time PCR Premix10μL，25mmol/L MgCl20.25μL，2.5mmol/L dNTP0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.125μL，WSSV、IHHNV和TSV上、下游引物及探针终浓度都分别为0.6，0.4和0.6μmol/L，体积均为2μL，其余用水补足。反应程序为：95℃预变性20s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行40个循环，最后于40℃结束反应。最后采用软件进行数据分析。

　　Tsv-F：5'-GCTTGCGTGGTGGG　　

　　ACTAAAT-3'　　

　　Tsv-R：5'-CCTCCACTGGTTG　　

　　TTGTATCAAAA-3'　　

　　Tsv-T：5'-HEX-AATGCCTGCT　　

　　AACCCAGTCGAAATT-ECLIPSE-3'

　　6、毒性分析

　　分别将合成的反义核酸药物注射对虾，每组100只，肌肉注射，400μg/只。注射后每天观察对虾的活动情况及是否出现死亡等，分组情况如表3和4。

　　7、临床试验

　　取南美白对虾，每尾10克左右，体长10-12cm，养殖温度（20±2℃）。实验毒株（WSSV和TSV），每组100尾。给药方式采用投喂法。　　

　　（1）感染途径　　

　　病毒滤液的制作同前，取WSSV感染病虾的鳃、上皮、肌肉、步足和头部软组织，加入缓冲液PBS（pH714）匀浆，8000g离心10min去沉淀，上清液用0.45μm滤膜过滤，得到可供感染的病毒滤液。　　

　　感染途径，投喂感染，用上述获得的病毒滤液注射感染健康对虾，采集因此感染而濒临死亡的虾，-20℃保存，作为投喂感染模式的病虾。感染时取该样品的鳃部、上皮、肌肉、步足和头部，剪细制成肉糜，用青霉素和链霉素处理0.5h，攻毒组幼虾饥饿空胃24h后投喂病虾肌肉肉糜一次，6h以后，清除残余物。然后继续投喂各相应饵料，同时设立阴性对照。　　

　　症状观察　　

　　感染后，每日观察对虾的活动情况，病死情况，10天后随机抽取部分对虾进行病毒检测。　　

　　（2）病毒检测　　

　　WSSV和TSV的检测方法同前。　　

　　（3）数据分析　　

　　数据统计分析结果如表5和6。

　　二、结果

　　1、人工感染试验　　

　　（1）WSSV感染与检测　　

　　结果表明，注射感染WSSV悬液的虾与自然患白斑病的病虾有同样的白斑病症状，注射感染组28h后有死亡个体出现，36-48h达到死亡高峰期，病毒感染阳性组72h内死亡率达到100%，感染个体8h后即不摄食，不运动，反应力差，20h后就有红体出现，28h可见到感染虾出现白斑，在28h后全部虾均有红体和白斑出现。濒死虾甲壳变软，血淋巴液发黄，不易凝固，各实验组死亡率见表3，死虾均出现典型的白斑症状。　　

　　对实验中死亡的对虾采用进行PCR检测，分别展开两次扩增，PCR完成后取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。一扩产物DNA片段长约为328bp，二扩产物DNA片段长约为258bp。所有病毒感染后出现死亡的虾在两轮扩增中均出现相应的条带，阴性对照组（健康对虾）均未检出相应的条带。　　

　　（2）TSV感染与检测　　

　　感染TSV的对虾早期体色变深，体表发红，呈深红色或褐色，尾扇和游泳足的颜色变化最为明显，进食减少或不食，剖检病虾空胃，严重者肝胰脏肿大或糜烂，体表可出现大量大小不一、散状分布的不规则黑色斑点等。　　

　　针对TSV的检测采用的是定量PCR进行检测，结果表明，TSV感染死亡组的虾均能检测TSV病毒，阴性对照组（健康对虾）均未检出。各实验组保护率见表4。　　

　　2、抗WSSV和TSV反义核酸序列的筛选　　

　　综合WSSV和TSV感染实验结果，选出针对WSSV和TSV的反义核酸的相对优选序列，如表5。　　

　　3、毒性实验结果　　

　　分别将WSSV和TSV的反义核酸的肽核酸序列注射对虾以检测它们作为药物的毒副作用，将合成的反义核酸药物注射对虾，每组100只，肌肉注射，400μg/只。注射后每天观察对虾的活动情况及是否出现死亡等，结果如表6和7。　　

　　4、临床实验　　

　　综合前述的各实验结果，选出针对WSSV和TSV的反义核酸的优选的肽核酸序列，以此为药物展开临床实验，分析它们作为对虾药物的可能性，表8和9列出了各药物对WSSV和TSV感染的保护率。　　

　　三、讨论　　

　　对虾桃拉综合症和白斑综合征和自大规模暴发以来，各国学者一直在不断的寻找预防和控制WSSV和TSV感染的方法。反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因（mRNA或DNA）的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNaseH识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。如2005年，Robalin等报道了利用RNA干扰在对虾上有效的抑制了内源基因的表达，同时通过抑制病毒基因的表达提高对虾对病毒的抗性进行了研究。　　

　　同年Tirasophon等的实验室也利用RNA干扰技术有效的在对虾原代细胞上抑制了黄头病毒的复制。这提示反义核酸可作为病毒相关分子模型被无脊椎动物免疫系统识别，并激活内部抗病毒反应，但他们采用的是注射的方法进行给药，这严重影响了水产动物的给药。开发有效且便于使用的反义核酸药物是研究人员要解决的关键。PNA作为一种新的DNA类似物具有广泛生物学效应，包括调节DNA识别蛋白质的功能以及调节转录与翻译，因而它作为反基因和反义治疗药物具有很大的潜能。Cohen报告，用肽核酸溶液（Reticulose)治疗乙肝病人15天，83%病人胆红素水平达正常范围，而用安慰剂治疗的病人均未恢复正常。用Reticulose治甲肝病人，100%病人在30天后胆红素正常，对照组仅有22%病人达正常。将反义肽核酸应用于对虾防治病毒目前在国内尚未见报道。　　

　　病毒衣壳蛋白是病毒最主要的组成成分之一，其主要功能是对病毒核酸形成保护性外壳，同时参与病毒粒子对细胞受体的吸附，是病毒结构与功能的体现者。WSSV的VP19和VP28是两种重要的结构蛋白，与WSSV的感染过程密切相关。TSV的CP1和CP2是由ORF2所编码的两种主要衣壳蛋白，不同分离株CP1基因差异在0-2.4%之间，CP2基因差异在0-24%之间。本实验针对WSSV（VP19和VP28）和TSV（CP1和CP2）的保守区域分别设计反义核酸，并以肽核酸形式合成。　　

　　直接以两种病毒的敏感动物——对虾展开一系列的实验，分析它们的毒性、稳定性及抗病毒效果等。所合成的反义肽核酸经流通蒸汽高温105℃，20分钟灭菌不影响其生物活性；在50℃存放2个月不影响其生物活性；室温存放24个月不影响其生物活性；低温：-20℃存放48个月不影响其生物活性。同时抗病毒效果表明，两种抗病毒药物均在对虾上取得了良好的保护率，分别达到98%和97%。另外本实验所设计的反义核酸可采用拌料法进行对虾给药，综合这些结果，提示反义肽核酸药物可作为对虾的抗病毒药物在临床使用。同时可避免因使用化学抗病毒及抗菌药物所产生的药残超标等问题，从而提高对虾产品的质量。